基因组科学概论A PRIMER OF GENOME SCIENCE
第二章 · 2.4

2.4 测序完成与缺口填补

Finishing and Gap Closure

本节摘要　本节讨论基因组序列从草图到完成图之间的最后阶段。首先给出“完成”的操作性定义——连续性、不低于 99.99% 的一致序列准确率与单倍体代表性（杂合位点的 IUPAC 兼并码处理）；继而区分顺序缺口与物理缺口两类待补缺口及其成因，介绍引物步移、缺口跨越 PCR、物理图谱锚定与替代文库等填补策略，梳理以预完成与 Consed 人工审查为核心的完成流程与质量保证，并以人类基因组草图（2001）到完成图（2004）的演进重估“完成”在 NGS 时代的相对意义。

2.3 节展示了鸟枪法如何把数百万条读段合并为 contig 与 scaffold，但拼装的自然产物只是草图(draft sequence)：序列被缺口切分、局部覆盖单薄、一致序列中仍残留可疑碱基。从草图到完成图(finished sequence)之间，还有一段以人工判断为主、昂贵而琐碎的路程，业内称为序列完成(finishing)（Gibson & Muse, 2009）。本节讨论三件事：完成标准是什么、缺口从何而来又如何填补、完成流程如何组织与把关；最后回到一个更具反思性的问题——在通量远胜精度的年代，“完成”还值不值得。

2.4.1 「完成」的操作性定义：连续性、准确率与单倍体代表性

“完成”并非自明的概念，它是在人类基因组计划的推进中被逐步制度化的。1996 年百慕大国际战略会议及其后数次后续会议在确立数据 24 小时公开原则的同时，也规定了完成序列的质量标准，通常概括为三个操作性要素。其一为连续性：理想情况下序列应无缺口；若确有无法闭合的缺口，其位置、大小与性质必须界定清楚并随序列一并记录，而不允许含混的断裂。其二为准确率：一致序列的错误率不得超过每 10 000 bp 一个错误，即准确率不低于 99.99%。其三为单倍体代表性：参考序列代表单倍体基因组，杂合位点原则上应以 IUPAC 兼并码(IUPAC ambiguity codes)（如 R = A/G、Y = C/T、M = A/C）记录两条同源染色体各自贡献的碱基，或明确择取其一并另行登记变异。

准确率标准可以从量级上理解其必要性。按 2.1 节的质量值定义，一致序列的期望错误数与长度、平均质量值之间有如下关系：

Nerr ≈ L × 10 −Q/10 (2.4-1) L：一致序列长度（bp）；Q：整段序列的平均质量值（式 2.1-2 的标度）；Nerr：期望错误数。例：L = 10 kb、Q = 40 时 Nerr ≈ 1，对应 99.99%；若 Q = 30，则 Nerr ≈ 10，超标十倍。据此，完成标准在质量值语言中大致等价于“一致序列整体达到 Q40 量级”。

把这一量级放到人类基因组上便知标准为何定得如此苛刻：3.1×10⁹ bp 的基因组若只有 99.9% 的准确率，期望错误数约为 3×10⁶ 个——与两个无关个体之间真实遗传差异的总量处于同一量级。换言之，低于 99.99% 的参考序列，其“错误”会淹没使用者的“发现”，变异检测、比较基因组学乃至基因注释都将在噪声上展开。完成标准不是审美洁癖，而是下游分析对信噪比的现实要求。

习题 2.4-1

某参考基因组项目拟将杂合位点一律以 IUPAC 兼并码写入正式提交的参考序列。试从以下角度说明这一做法为何存在争议：(1) 参考序列的单倍体属性；(2) 兼并码字符串与任何一条真实单体的关系；(3) 对下游蛋白质翻译与变异检测的影响。

参考解答

(1) 完成标准要求参考序列代表单倍体基因组，而兼并码实际上把两条单体的信息叠加进了一行字符串，参考序列由此不再是任何真实存在的单倍型。(2) 例如两条单体分别为 …ACT… 与 …AGT… 时记为 AR T? 此例中位点记作 R（A/G），所得字符串既不对应单体 1 也不对应单体 2，是一种“平均化”的表示；对跨越多个杂合位点的单倍型连锁关系，一行兼并码更是完全无法表达。(3) 翻译编码序列时含兼并码的密码子可能被解释为多个氨基酸，引入不存在的蛋白变异；变异检测流程若把参考序列中的 R 视为确定碱基，会产生系统性的假阳性或假阴性。因此多数完成项目采取折中：参考序列择取一个等位基因，杂合信息另行以变异记录提交，兼并码仅用于明确注明的情况下。

2.4.2 两类缺口：顺序缺口与物理缺口

finishing 的核心困难在缺口。按信息状态的不同，缺口分为两类，其可操作性相差悬殊。

定义

顺序缺口（sequence gap）：两侧 contig 在 scaffold 中的次序与方向均已确定（通常由配对末端或大插入克隆跨连证实），缺口内部确有 DNA 存在、只是尚未测出；拼装中以一定数目的 N 占位，长度仅有估计值。物理缺口（physical gap）：两侧 contig 之间的次序、方向乃至缺口大小均未知，甚至不能确定缺口处是否存在序列——基因组某区段可能在全部现有文库中都无代表，拼装图上呈现的是真空而非空洞。

二者的实用区别在于：顺序缺口是“已定位的待测任务”，可用定向实验直接进攻；物理缺口是“未定位的未知”，须先恢复位置信息才谈得上测序。

两类缺口的成因不同。克隆缺区是顺序缺口的常见来源：某些区段在大肠杆菌宿主中不稳定（如极端 GC 含量、编码毒性产物、含串联重复），在所有克隆中被系统性删除或重排，于是鸟枪法文库始终“取不到样”；两侧 contig 因大插入克隆末端序列的跨连而知道彼此相邻，中间却无克隆可测。重复序列则更多制造物理缺口：长于读长的重复使拼装图在同一位置打结、坍缩或断裂，断点两侧的 contig 既无重叠也无配对证据互连，次序无从谈起（2.3 节）。末端与特殊结构问题指端粒内侧亚端粒区、着丝粒卫星 DNA 与 rDNA 串联阵列等——这些区段不仅重复度高，且在克隆中极不稳定，是物理缺口最顽固的藏身之处；人类参考基因组长期无法闭合的部分正在于此。

支架（scaffold）中的两类缺口 染色体上位置已知的区段（示意） contig A：方向已知（右向），与 contig B 相邻 contig A 顺序缺口：两侧 contig 次序与方向已知，缺口内有未测出的 DNA，以 N 填充，长度由配对末端估计 N·N·N contig B：由配对末端跨连定位在 contig A 之后，方向已知 contig B 物理缺口：两侧 contig 的次序、方向与缺口大小均未知，甚至不确定是否存在序列 ? contig C：与 contig B 之间无重叠、无配对证据，相对位置未知 contig C 配对末端读段（两端小圆点）跨过缺口，证实两侧 contig 相邻且方向确定 配对末端跨连 1 2 1 · 顺序缺口：次序与方向已知，缺口内确有未测 DNA（N 填充，长度可估）；常见成因为克隆缺区。 2 · 物理缺口：次序、方向与大小均未知，甚至不确定是否存在序列；常见成因为重复阻断与末端、着丝粒区问题。 另一种表现：两个 scaffold 无法互连，其间缺口亦属物理缺口 scaffold 2 ? scaffold 3 需借助物理图谱（FISH、BAC 末端锚定等）先恢复位置信息 深蓝块 = contig（小三角示方向）；灰虚框（N）= 顺序缺口；红虚框（?）= 物理缺口。悬停各元素可查看说明。
图 2.4-1　两类缺口的信息状态对比（示意）。支架中 contig B 与 contig A 之间由配对末端读段（两端小圆点）跨连，次序与方向确定，缺口内的 DNA 只是未测出，属顺序缺口；contig C 与 contig B 之间无任何重叠或配对证据，相对位置与缺口大小均未知，属物理缺口。两个互不连通的 scaffold 之间的缺口同样属物理缺口，须先以物理图谱手段定位，再图填补。
习题 2.4-2

某细菌基因组草图含三个缺口：缺口甲两侧的 contig 之间存在多对配对末端读段的跨连，N 区长度估计约 1.8 kb；缺口乙两侧的 contig 无任何跨连证据，且荧光原位杂交显示两者分别定位于染色体的两个远端区段；缺口丙两侧 contig 有跨连，但每轮针对缺口区设计的 PCR 均无扩增，进一步检查发现该区段 GC 含量约 72%。试判断三个缺口各属何种类型或何种困难，并提出相应的填补策略。

参考解答

甲：典型顺序缺口——次序方向已知、长度可估，直接以两侧末端引物做缺口跨越 PCR（或直接引物步移）即可。乙：两侧 contig 定位于不同染色体区段，说明二者并不相邻，“缺口”实为 scaffold 之间的断裂，属物理缺口情境；应先用 FISH、BAC 末端锚定或遗传图谱确定各自位置，再寻找可能介于其间的其他 contig 或克隆。丙：形式上是顺序缺口，但 PCR 屡屡失败与极端 GC 相符——高 GC 模板变性困难、易形成稳定二级结构；对策包括改用适应高 GC 的聚合酶与助溶剂体系、提高变性温度，或改走克隆路线（构建替代文库后以末端序列筛选跨缺口的克隆），而非反复重复常规 PCR。

2.4.3 缺口填补策略：从定向延伸到文库补救

对顺序缺口，最直接的武器是引物步移(primer walking)：在 contig 末端的已知序列上设计一条引物，以基因组 DNA（或跨缺口的克隆）为模板向缺口方向再测一轮 Sanger，读出约 600–800 bp 的新序列，把“已知”的边界向前推进一步；再在新末端上设计下一条引物，如此步步为营，直到与对面的 contig 会师。它简单、定向、无拼装歧义，缺点是每一步都要定制引物、通量极低，只能配给“最后一公里”。

方法

引物步移的实施要点。步移看似只是“测一段、设计一条引物”的循环，实践中须遵守若干规范：

  1. 引物位置：取 contig 末端内侧约 50–150 bp 处的高质量序列设计，避开低 Q 区与单链覆盖区，确保起点本身无误；
  2. 引物性质：长度一般 20–30 nt，退火温度与 GC 含量须落在扩增窗口内，3′ 端避免与重复或低复杂度序列重合，必要时以已知序列检索确认全基因组唯一，防止“走到别处”；
  3. 双侧并进：缺口两侧同时步移相向而行，除缩短日程外，两条链的测序互相印证，符合双链验证的质量要求；
  4. 步数核算：步数约为缺口长度除以有效读长（向上取整），过长缺口宜改用缺口跨越 PCR 或克隆策略，以免成本失控；
  5. 核对预期：每一步的新序列应立即与对面 contig 比对，一旦出现过早会师或方向异常，说明缺口长度估计或 contig 排布有误，须回查而非硬走。

当缺口较短且两侧序列已知时，缺口跨越 PCR(gap-spanning PCR)更为经济：在两侧 contig 的最末端各设计一条朝向缺口的引物，以基因组 DNA 为模板直接扩增缺口全长，再对产物测序。常规 PCR 适合数 kb 以内的缺口，长距离 PCR 可延伸至约 20 kb（量级，依酶与条件而异）。PCR 无扩增本身就是信息：缺口比估计值长、两侧次序有误，或该区段难以扩增（如高 GC、串联重复）。对物理缺口，则须先补上“位置”这一缺失的信息：荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)能把 contig 或克隆定位到中期染色体的具体区带，直接观察缺口两侧在染色体上的相对位置；BAC 末端序列锚定则把 contig 末端挂到物理图谱（指纹图谱、遗传图谱或 STS 图谱）上，既定次序又估计缺口大小，随后可用末端探针“钓取”延伸入缺口的相邻克隆，即克隆级步移。

若缺口源于文库本身的偏倚，治本之道是替代文库(alternative library)：以不同插入尺寸（质粒、cosmid、BAC 级别）、不同制备方式（机械剪切与不同限制酶的部分酶切产生不同的末端与片段谱）乃至不同载体与宿主菌株重新建库，绕开原文库“取不到样”的系统性盲区。原书出版于 2009 年，其时大型项目通常并行维护多套互补文库，正是出于这一考虑（Gibson & Muse, 2009）。

A · 引物步移：自 contig 末端向缺口定向延伸 contig L：缺口左侧的已知序列块 contig L 缺口（顺序缺口，长度有估计值） contig R：缺口右侧的已知序列块 contig R 步移读段 1：自 contig L 末端引物 P1 起延伸约 700 bp P1 读段 1（约 700 bp） 步移读段 2：以读段 1 的末端序列设计引物 P2，继续向缺口内推进 P2 读段 2 读段 3 与 contig R 重叠，两侧序列会师，缺口闭合 P3 与 contig R 重叠：会师，缺口闭合 每步以最新末端设计下一条引物；缺口约 4 kb 时单侧需约 6 步，双侧相向并行约各 3 步。 B · 缺口跨越 PCR：以两侧末端为引物直接扩增缺口片段 contig L 末端 contig R 末端 PCR 扩增：以缺口全长基因组 DNA 为模板，两个末端引物之间的片段被指数扩增 PCR 扩增（缺口全长为模板） 上游引物：结合于 contig L 末端、朝向缺口延伸 上游引物（正向） 下游引物：结合于 contig R 末端、反向朝向缺口延伸 下游引物（反向） 扩增产物：含缺口全部未知序列，可直接测序或在其上继续引物步移 产物直接测序，或在其上继续引物步移 适用于两侧已知且较短的顺序缺口（常规 PCR 数 kb 以内，长距离 PCR 约至 20 kb，量级估计）；无扩增常提示缺口更长、次序有误或模板难以扩增。
图 2.4-2　顺序缺口的两种定向填补策略。A 引物步移：自 contig 末端设计引物（P1、P2、P3），每轮读出约 700 bp 新序列并将已知边界前推，直至与对侧 contig 重叠会师；B 缺口跨越 PCR：两侧末端各设一条朝向缺口的引物，直接扩增缺口全长后测序。两法都以“两侧序列已知”为前提，物理缺口须先经物理图谱定位方可套用。悬停各元素可查看说明。
习题 2.4-3

某顺序缺口经配对末端估计长 4.2 kb，可用 Sanger 读段的有效读长为 700 bp，且引物须设计在末端内侧 100 bp 处。(1) 仅自左侧单侧步移，至少需要几条定制引物？(2) 双侧相向并行呢？(3) 若缺口跨越 PCR 一步扩出全长，比较三种方案的读数与引物数。

参考解答

(1) 每步净推进约 700 − 100 = 600 bp（新引物须落在已读序列内侧），步数 = ⌈4 200 / 600⌉ = 7 步，即 7 条引物与 7 条读段（末步与对侧重叠核对）。(2) 两侧并行时每侧各推进约 2 100 bp，每侧 ⌈2 100 / 600⌉ ≈ 4 步（考虑 100 bp 起步内退与末步重叠核对），合计约 8 条引物，但关键差别在于并行将串行日程缩短近半，且两侧序列互为双链印证。(3) PCR 方案仅需 2 条引物与一次扩增加随后的产物测序（1–2 条读段或在其上少量步移），读数与引物数最少；其代价是对聚合酶与条件更敏感，且若缺口长于约 20 kb 或模板难扩增即失效。方案选择因此取决于缺口长度与模板性质，而非单纯成本。

2.4.4 完成流程与质量保证

策略之外，finishing 更是一套组织严密的工作流。大规模中心的通行做法是分两段推进。预完成(pre-finishing)阶段以计算分析为主：对拼装产物逐区体检，找出覆盖不足（如少于若干条读段或仅单链覆盖）、质量值低下、一致序列存在未消解冲突（不同读段在同一位置给出互斥碱基）以及缺口周边的薄弱区，据此批量安排补测——重排模板、补测反向读段、对低覆盖区定向加测，使多数问题在进入人工阶段前已被数据冲淡。此后的正式 finishing 阶段则以人工审查为核心。

人工审查的标志性工具是 Green 实验室的Consed(graphical sequence finishing tool)（Gordon et al., 1998）。它把拼装结果呈现为一张可逐层下钻的视图：顶层是 contig 的拼装结构，其下是各读段相对一致序列的排列，最底层可调出每条读段的原始色谱图与逐碱基质量值。审查者沿“违规清单”推进——逐个查看低质量区、单链区、一致序列冲突与重复边界，对照四通道峰形判断冲突是真实变异（杂合）、读段错误还是拼装错位，据此编辑序列、重测读段或定制引物。Autofinish 程序更进一步，能按预设规则自动挑选低质量与单链区、自动设计补测引物并生成订购单，把大量程式化决策交给计算机（Gordon et al., 2001）。如此“机器列单—人工裁决—补测—再拼装”循环往复，直至违规清单清空。

质量保证的最后关口是一组成文的验收条件。除百慕大式的外部标准外，各中心通常自设更细的内部门槛，常用者如：完成序列的绝大部分乃至全部碱基达到 Q40 量级（对应式 2.4-1 中每 10 kb 期望错误不超过 1 个）；每个位置至少由两条相互独立的读段覆盖，且两条链兼有，最好还包含两种测序化学（染料引物与染料终止子）的结果，以排除某一种化学特有的压缩与伪峰；一致序列不得残留未经解释的冲突，缺口必须逐一登记性质与闭合状态。这类内部标准并无全网统一的数值，此处按业内的通行做法概述。把关之所以如此严格，是因为 finishing 的开销巨大：以人类基因组计划为例，草图公布（2001）到完成图发表（2004）又用了三年多，这段时间的工作几乎全部属于 finishing 与质量保证，业内普遍认为该阶段的人力与试剂开销与前期生产测序处于同一量级（定性估计，无统一统计；Gibson & Muse, 2009）。高门槛既是质量要求，也是对昂贵返工的预防。

2.4.5 草图与完成图：人类基因组的两步走

人类基因组计划为“草图—完成图”两阶段提供了最完整的注脚。2001 年公布的草图覆盖约 90% 的常染色质区（按该文报告的统计口径），但序列被约 1.5×10⁵ 个缺口切分，其中相当一部分缺口的大小与所在均不确定（IHGSC, 2001）；同年 Celera 以全基因组鸟枪法路线独立发表的序列同样以草图形态呈现（Venter et al., 2001）。到 2004 年，国际联盟宣布常染色质序列完成：覆盖率达 99% 以上，缺口骤减至 341 个，整体错误率估计约为每 100 kb 1 个，优于百慕大标准（IHGSC, 2004）。缺口数目由此下降两个数量级以上——这三年多的时间，几乎全部投入在本节所述的预完成、人工审查与定向填补之中。

人类基因组缺口数量的量级变化（对数刻度示意） 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 2001 草图：常染色质覆盖约 90%，约 1.5×10⁵ 个缺口，相当部分大小与位置未定 约 1.5×10⁵ 个 2004 完成图：常染色质覆盖 99% 以上，缺口 341 个，整体错误率估计约每 100 kb 1 个 341 个 2022 T2T-CHM13：补齐着丝粒卫星 DNA 等最后缺口，首个基本无间隙的完整人类基因组（括注引） 基本为 0 减少两个数量级以上 2001 草图 2004 完成图 2022 T2T-CHM13 常染色质覆盖约 90%（IHGSC） 覆盖 99% 以上（IHGSC） 补齐最后重复区（括注引） 数据：IHGSC 2001、IHGSC 2004、Nurk et al. 2022；柱高按缺口数的常用对数示意，非线性比例。
图 2.4-3　人类基因组缺口数量的量级变化。草图（2001）含约 1.5×10⁵ 个缺口；完成图（2004）将缺口减至 341 个，下降两个数量级以上，剩余者集中于重复度极高的区段；直至 2022 年端粒到端粒（T2T）联盟方以 CHM13 细胞系补齐包括着丝粒卫星 DNA 在内的最后缺口，得到首个基本无间隙的完整人类基因组（Nurk et al., 2022，括注引）。柱高为对数刻度示意。

此后技术经济学改变了权衡。NGS 把生产测序的边际成本压低了几个数量级，而 finishing 仍以人工与定向实验为主，成本几乎未同步下降，于是“测得多”与“测得完”迅速分家：绝大多数基因组计划止步于高质量草图，逐碱基完成仅保留给参考级生物与特定需求（Gibson & Muse, 2009）。“完成”的意义也随之被重估——它从默认目标变成一种按需选配的深度等级。至于人类参考基因组本身，2004 年完成图仍未触及的着丝粒、亚端粒与卫星 DNA 一直遗留到长读长时代方告收束（其后的 T2T-CHM13 于 2022 年闭合了这些最后缺口，见 Nurk et al., 2022）。

注记

完成标准的相对性。“完成”不是序列的内在属性，而是序列与用途之间的契约：做基因目录与初步注释，高质量草图通常已敷使用——缺口间的 contig 足以承载大多数基因预测（见 2.5 节）；做断裂位点水平的结构变异分析、比较基因组学的重排精细比对或临床级参考，则必须依赖完成图，因为未定位的缺口正是结构变异最常藏身之处；而着丝粒卫星、核糖体 DNA 阵列一类问题，则要求长读长时代的专门方案。可以类比建筑验收：仓库与手术室的验收标准不同，并非仓库可以偷工减料，而是用途规定了必须担保到什么程度。审视任何一篇基因组论文时，都应先看它报告的究竟是草图、完成图还是介于其间的等级，再决定其结论可外推多远。

关键术语

序列完成 (finishing)
把草图序列提升到既定完成标准（连续性、准确率、单倍体代表性）的全过程，以定向补测与人工审查为主。
草图 (draft sequence)
鸟枪法拼装的自然产物：序列被缺口切分、局部覆盖与一致序列质量尚未全面达标。
完成图 (finished sequence)
达到完成标准的序列：无缺口或缺口已界定清楚，错误率不超过每 10 kb 一个（准确率不低于 99.99%）。
顺序缺口 (sequence gap)
两侧 contig 次序与方向已知的缺口，缺口内确有未测出的 DNA，可用定向实验直接填补。
物理缺口 (physical gap)
两侧 contig 次序、方向与缺口大小均未知的缺口，须先以物理图谱恢复位置信息。
引物步移 (primer walking)
在已知序列末端设计引物逐轮定向延伸、把已知边界逐步推进直至会师的测序策略。
缺口跨越 PCR (gap-spanning PCR)
以缺口两侧末端为引物直接扩增缺口全长片段再测序的填补方法，适用于较短的顺序缺口。
替代文库 (alternative library)
以不同插入尺寸、制备方式或载体宿主构建的互补克隆文库，用于绕开原文库的系统性缺区。
预完成 (pre-finishing)
进入人工审查前的批量整备阶段：低覆盖区补测、单链区补反向读段、消解一致序列冲突。
IUPAC 兼并码 (IUPAC ambiguity codes)
以单字母表示不确定或双重碱基的记号体系（R、Y、M 等），完成序列中用于标注杂合位点。

参考文献与延伸阅读

  1. Gibson G, Muse SV. 2009. A Primer of Genome Science, 3rd ed. Sunderland (MA): Sinauer Associates. (Chapter 2)
  2. Gordon D, Abajian C, Green P. 1998. Consed: a graphical tool for sequence finishing. Genome Research 8: 195–202.
  3. Gordon D, Desmarais C, Green P. 2001. Automated finishing with autofinish. Genome Research 11: 614–625.
  4. International Human Genome Sequencing Consortium. 2001. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409: 860–921.
  5. International Human Genome Sequencing Consortium. 2004. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 431: 931–945.
  6. Lander ES, Waterman MS. 1988. Genomic mapping by fingerprinting random clones: a mathematical analysis. Genomics 2: 231–239.
  7. Nurk S, Koren S, Rhie A, et al. 2022. The complete sequence of a human genome. Science 376: 44–53.（T2T 联盟，正文括注引）
  8. Venter JC, Adams MD, Myers EW, et al. 2001. The sequence of the human genome. Science 291: 1304–1351.