4.1 转录组的概念

第四章导言指出：基因组科学的前两重维度——序列的测定与个体间变异的编目——处理的是近乎恒定的遗传物质；而细胞生物学的中心问题之一，是同一套遗传指令如何产生肝细胞、神经元与淋巴细胞这些形态功能迥异的细胞类型。答案不在「零件清单」的差异，而在基因表达(gene expression)的时空调控：每个细胞在每一时刻只把基因组中的一部分基因转录为 RNA，再翻译为蛋白质。系统测量这一「正在被读取的部分」，便是本章的操作对象——转录组。本节先厘清概念本身，再回顾测量技术从一次一个基因到全基因组并行的发展脉络，为后续各节的技术细节（4.2 节、4.3 节）与统计方法（4.4 节、4.5 节）铺设概念地基。

4.1.1 转录组的操作性定义

与前两章讨论的「一个」参考基因组不同，转录组在定义上就绑定了具体的细胞与时刻。可以把上述直觉整理为一个可操作的定义。

就化学组成而言，细胞总 RNA 的主体是 rRNA（通常占 80% 以上）与 tRNA，mRNA 一般只占百分之几；因此多数转录组测量先以 poly(A) 选择或 rRNA 扣除富集 mRNA。一个典型哺乳动物细胞约含数十万个 mRNA 分子，涉及上万种转录本，拷贝数从每细胞个位数到数十万，跨越四到五个数量级——这一宽广的动态范围，是后续所有测量技术必须面对的困难之一（Gibson & Muse, 2009）。

转录组与基因组的差异可以概括为五个维度：信息容量、稳定性、细胞特异性、测量单位与技术路线。

4.1.2 基因表达的调控层次

要理解转录组为何动态、为何细胞特异，需要分解基因表达的调控层次。第一层是转录起始。RNA 聚合酶 II 能否在启动子(promoter)处起始，取决于转录因子(transcription factor)与顺式调控元件的组合结合：启动子附近的元件决定基础转录水平，远端的增强子(enhancer)则以位置与方向不依赖的方式放大或赋予组织特异性。人体转录因子只有约两千种，却足以支撑数百种细胞类型，关键在于组合逻辑(combinatorial control)：同一组转录因子以不同的组合、不同的剂量与不同的修饰状态结合，产生截然不同的输出（Alberts et al., 2008）。发育生物学所谓「程序切换」，在分子层面正是转录因子组合的更替。

第二层是染色质可及性(chromatin accessibility)。真核基因组以核小体为单位包装，启动子与增强子若被紧密包装的染色质遮蔽，转录因子无从结合。组蛋白的乙酰化、甲基化等修饰与核小体重塑决定特定区段处于「开放」还是「关闭」状态；经典的 DNase I 超敏感位点即是开放染色质的实验标记。可及性在发育中随谱系分化渐进收窄，是细胞类型特异性表达的染色质基础。

转录之后还有两个常被初学者忽略的层次。其一是 RNA 稳定性：不同 mRNA 的半衰期从数分钟到数小时不等，富含 AU 元件的转录本往往降解更快；细胞可以通过改变降解速率在不动转录机器的情况下迅速调整特定 mRNA 的水平。其二是翻译调控：mRNA 的亚细胞定位、5′ 帽结构与 poly(A) 长度、上游开放读码框以及微小 RNA 的结合，都影响同一 mRNA 产出多少蛋白质。因此，mRNA 丰度只是基因表达调控链条上的一个中间读数：它反映「有多少 RNA 可供翻译」，却不等于「有多少蛋白被合成」——转录组与蛋白质组的相关性通常仅为中度，这一问题将在第五章系统讨论。

调控层次的存在意味着：外界信号触发的不是零散的个别基因变化，而是成套的表达程序切换。经典的例证是酵母的二峰生长转变（diauxic shift）：培养基中的葡萄糖耗尽后，酵母在数小时内从发酵代谢整体切换为呼吸代谢，全基因组尺度的测量显示约四分之一的基因表达发生显著改变（DeRisi et al., 1997）——这是史上第一张全基因组表达时间进程图，我们将在 4.8 节作为应用实例回顾。发育过程中的谱系分化、热激反应、病原入侵后的免疫激活，都属同类「程序级」变化。既然变化以程序为单位，测量手段就必须能同时观察成千上万个基因——这正是高通量技术的动因。

4.1.3 低通量时代的技术谱系

在并行测量出现之前，基因表达研究依赖一套「一次一个基因」的技术谱系。它们各自解决了某一类问题，也各自受制于通量。

Northern 印迹(Northern blot)是最早的通用 RNA 检测方法（Alwine et al., 1977）：提取总 RNA，经变性琼脂糖凝胶按大小分离，毛细转移至膜上，再用标记的序列特异探针杂交(hybridization)显影。它的独特优点是条带位置直接给出转录本大小：一个基因若存在多种可变剪接 isoform，膜上便出现多条带， Northern 因此至今仍是验证剪接变化的参照方法。其局限同样明显：一张膜只能问一个基因（一条探针），需要微克量级的总 RNA，灵敏度有限，且条带强度只能半定量。

反转录 PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)与其定量形式改变了灵敏度格局：先将 RNA 反转录为 cDNA，再以基因特异引物扩增；实时定量 PCR（qPCR）在扩增过程中监测荧光，达到设定阈值的循环数记为 Ct 值(threshold cycle)。由于每个循环（理想效率下）使产物翻倍，起始模板越多、荧光越早越线，Ct 与起始拷贝数的对数呈线性负相关。以看家基因为参照基因做相对定量，即得经典的 ΔΔCt 方法：

qPCR 灵敏度高、动态范围宽，至今仍是验证少量基因差异表达的「金标准」。其通量却停留在 96 或 384 孔的规模：测三千个基因即意味着三千对引物与三千次反应，全基因组尺度的普查不可行。

与前两者互补的是原位杂交(in situ hybridization)：以标记探针在固定的组织切片或整体胚胎中直接杂交目标 RNA，保留空间信息——某基因表达于胚胎的哪一体节、肿瘤的间质还是实质，只有这类方法能够回答。它同样一次只测一个到数个基因。此外还有两类用于「发现」差异基因的方法：差减杂交(subtractive hybridization)用过量对照 cDNA 与处理组 cDNA 杂交，洗去共有序列以富集差异转录本；差异显示(differential display)以锚定引物与随机引物组合扩增 cDNA 片段并在凝胶上并排比较条带。二者都能筛出候选差异基因，但操作繁琐、假阳性率高，且每次只能比较一对条件。

4.1.4 EST 与基因发现

与杂交路线并行，测序路线也发展出面向表达的分支。表达序列标签(expressed sequence tag, EST)的思路极为朴素：从组织或细胞构建 cDNA 文库(cDNA library)（以成熟 mRNA 为模板反转录并克隆的文库），随机挑选克隆做单轮部分测序（典型读长数百碱基），得到的每条短序列都是「该基因在此组织中正在表达」的凭证（Adams et al., 1991）。EST 把基因发现从「先定位再测序」的作图路线，改为「直接从表达产物下手」的发现路线：不必预先知道基因座，序列本身即可通过与已有数据的比对归入或发现一个基因。

大规模 EST 计划在 20 世纪 90 年代迅速展开。到 1990 年代中期，人脑、肝等多种组织的 cDNA 文库已被系统抽样，仅一项汇总分析即覆盖了 8300 万个核苷酸的 cDNA 序列（Adams et al., 1995）；公共数据库 dbEST(database of expressed sequence tags)随之建立，以组织来源标注每条 EST，成为从表达数据中发现新基因的检索基础设施（Boguski et al., 1993）。到 2000 年代中期，dbEST 收录的人类 EST 已达数百万条的量级（NCBI dbEST 统计；原书出版于 2009 年，此后 RNA 测序逐步取代 EST 产出）。

EST 对转录组概念的第二重贡献是揭示剪接多样性：来自同一基因的多条 EST 若比对到不同的外显子组合，即直接证明了可变剪接的存在；大规模 EST 比对使「人类多外显子基因中的相当多数存在可变剪接」这一估计成为共识（比例随年代与数据集而异）。为把零散的 EST 组织成基因尺度的知识，NCBI 构建 UniGene(gene-oriented clustering)：以序列相似度（BLAST）把来自同一基因的 EST 与全长 mRNA 自动聚为同一个基因导向的簇，一簇约对应一个基因。UniGene 由此成为早期探针设计与基因注释的常用参照（Gibson & Muse, 2009）。

更进一步，EST 频率本身携带定量信息：在未经均一化处理的 cDNA 文库中，随机抽样得到的某基因 EST 条数应近似正比于其 mRNA 丰度——条数之比即丰度之比的粗估计。这一「以序列条数度量表达」的思想受制于克隆偏倚与抽样噪声（文库小、稀有转录本常漏检，详见习题 4.1-2），却是后来标签计数技术的直接先声：Velculescu 等（1995）提出的基因表达系列分析（SAGE）以规范化短标签替代整条 cDNA，把「计数即定量」做成了严格方法，我们留待 4.6 节专门讨论。

4.1.5 高通量测量的认识论

通量的跃升改变的不只是实验速度，还有推断的逻辑，这是本节最后要确立的认识论前提。其一是多重比较问题：单基因时代对个别基因做 α = 0.05 的检验，风险可控；当一次实验同时检验一万个基因时，即便没有任何真实差异，期望也会出现约 500 个「显著」基因——假阳性从偶发事件变成必然事件。因此高通量数据的显著性必须以族错误率或假发现率(false discovery rate, FDR)的框架重新校准，这构成 4.4 节的主题。其二是噪声结构的变化：高通量平台引入了单基因实验没有的系统性变异来源——探针间的交叉杂交与结合效率差异、芯片上的空间斑驳、扫描增益与染料效率的漂移、样品制备的批次效应。这些噪声不是独立的随机扰动，而是结构化偏差，必须以归一化方法显式建模（4.4 节）并在实验设计阶段预先阻断（4.3 节）。其三是维数灾难带来的机会与风险：样本数通常只有几十，变量却有上万，任何「先看数据再挑基因」的操作都会制造过拟合——这提示无监督的模式发现（4.5 节）必须与谨慎的验证相结合。

支撑全章分析的公共数据对象由此确定：表达矩阵(expression matrix)。

表达矩阵是湿实验室与统计学之间的接口：微阵列图像分析（4.3 节）的产物是它，归一化、差异检验、聚类与分类（4.4、4.5 节）的输入是它，标签计数与 RNA 测序（4.6、4.7 节）最终也归约为同一结构——只是「强度」换成「读段计数」。围绕这一矩阵，本章的叙述顺序为：先讲两大微阵列平台的原理与实验设计（4.2、4.3 节），再建立从原始强度到可信结论的统计链路（4.4、4.5 节），继而引入以计数为基础的标签技术与 RNA 测序（4.6、4.7 节），最后以应用实例收束（4.8 节）。