3.1 节区分了遗传变异的主要类型，但类型学只是起点：要把变异用作遗传标记，必须先在群体样本中把此前未知的多态位点找出来，再在成千上万个个体中把每个位点的基因型逐一读出来。前者是变异发现(variant discovery)，后者是基因分型(genotyping)——对给定个体、给定位点，判定其基因型属纯合 AA、杂合 Aa 还是纯合 aa。二者的技术经济逻辑几乎相反：发现强调灵敏度与假阳性控制，通常几十个个体即可开展；分型强调准确、便宜与可重复，规模动辄以亿计的"个体 × 位点"组合来衡量（Kwok, 2001；Gibson & Muse, 2009）。本节先讨论 SNP 如何被发现，再按等位区分所依赖的物理与酶学原理梳理分型技术谱系，深入三个代表技术的机理，最后给出质量控制与选型的操作性框架。
3.2.1 SNP 的发现：重测序流水线与抽样效应
发现 SNP 最直接的途径是重测序比对：对若干无关个体的基因组（或其代表性区段）随机测序，把读段比对到参考基因组上，在比对结果的逐列堆叠中寻找系统性的碱基分歧。经典流水线分四步：
- 质量过滤：剔除整条低质量读段，或修剪其低质量末端与残余接头序列——末端碱基的错误率最高，是后续一切误判的源头；
- 比对：将读段定位到参考基因组，理想情况下每个读段只有一个唯一、高质量的结合位置；
- 堆叠：把比对到同一位置的读段碱基按列叠放，形成读段堆叠(pileup)，每个基因组位置得到"参考碱基 + 若干观察碱基"的列；
- 等位频率与覆盖深度过滤：只保留满足最小深度、最小次等位计数、两条链均有支持、读段方向平衡等条件的候选位点。
绝大多数列中所有读段与参考一致；少数列出现两种碱基的错配堆叠。此时有三种解释，必须逐一甄别。真多态的特征是：次等位出现在多条相互独立的读段上、正反两条链的读段中均出现、在多个个体中以彼此一致的碱基重复出现，且各位点的等位频率谱符合群体预期。测序错误则相反——集中于读段末端与低质量值碱基、往往只见于一条链、在个体间不重复，随机而不成体系。第三种最难处理：旁系同源序列(paralog)造成的比对歧义。重复基因家族成员之间的差异是真实存在的遗传差异，但当某拷贝的读段被错误地映射到另一拷贝上时，这些差异会在固定位置堆积成高频率的"多态"，其典型指纹是异常增高的覆盖深度、显著的链偏置与偏低的作图质量值。可靠的发现流程因此要求读段唯一比对，并在重复区段设置更严格的过滤。
变异发现（variant discovery）：在群体样本中寻找此前未知的多态位点，核心指标是灵敏度（不漏）与假阳性率（不误报），通常在几十至几百个个体的小 panel 上进行，等位基因频率只需粗略估计。基因分型（genotyping）：对已知位点在大样本中逐一判读基因型，核心指标是每个"个体 × 位点"的准确率、通量与成本。二者对错误的容忍方向不同：发现端可以容忍频率不确定、但不能容忍系统性假阳性污染数据库；分型端可以容忍个别样本判读失败（记为 no-call），但不能容忍把一种基因型系统性地错判为另一种。
发现 panel 的抽样效应决定了"多大的 panel 能发现什么"。一个次等位基因频率为 q 的 SNP，在 n 个二倍体个体（2n 条染色体）中一次也不被观察到的概率为
正是依据这一逻辑，SNP 联盟（The SNP Consortium）以多个人群的多样性 panel 与既有序列数据开展系统发现，于 2001 年发表了包含约 142 万个 SNP 的人类变异图谱，为后续的单倍型计划与商业化芯片奠定了位点基础（Sachidanandam et al., 2001）。
重测序之外，芯片重测序提供了另一条发现路径：在寡核苷酸芯片上为每个目标位点设计一组覆盖全部四种可能碱基的探针，将多样性 panel 的基因组 DNA 与之杂交，比较各探针的强度模式即可推断该位点的碱基组成，从中识别多态位点。这条路线一次实验可扫描数十万个位点，无需测序仪，但其分辨率受杂交非特异性限制——对探针上预先设计的区段有效，无法发现设计之外的新变异，杂合位点的判读也依赖强度比而非直接的分子证据。
习题 3.2-1
某团队拟用重测序 panel 发现次等位基因频率不低于 0.05 的 SNP，希望以不低于 95% 的概率在每个这样的位点上至少观察到一次次等位基因。至少需要多少条染色体？若目标改为频率不低于 0.01 的 SNP，又需要多少？进一步说明：为什么"发现一个 SNP"与"准确估计其等位基因频率"所需的样本量相差悬殊。
参考解答由式 (3.2-1)，(1 − q)2n ≤ 0.05。q = 0.05 时 2n ≥ ln 0.05 / ln 0.95 ≈ 58.4，故至少约 60 条染色体（30 个个体）；q = 0.01 时 2n ≥ ln 0.05 / ln 0.99 ≈ 298，即约 300 条染色体。发现只需次等位基因出现一次，而频率估计要求观察到足够多的次等位拷贝：按二项抽样，频率估计的标准误约为 [pq/(2n)]1/2（p = 1 − q），若希望 q = 0.05 的相对标准误不超过 10%，需 (1 − q)/(2nq) ≤ 0.01，即 2n 约 1900 条染色体——比"见到一次"所需多约三十倍。因此发现 panel 可以小，频率估计 panel 必须大，这正是"发现—分型"分工的统计学根据。
3.2.2 等位区分的信号物理学：六类原理
一切分型技术都可以分解为两个环节：等位区分——让两种等位基因产生可辨别的不同分子事件；信号读出——把该事件转换为荧光、片段长度或分子质量等可测量的物理量。读出手段相对有限，真正的差异在于区分环节所依赖的分子识别原理，可归为四类（Kwok, 2001）：
- 杂交特异性：完全配对与单碱基错配的双链在解链温度(melting temperature, Tm)上的差异。短探针中央一个错配可使 Tm 下降数度至十余度，在严谨杂交条件下即可区分。等位基因特异性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide, ASO)杂交与高密度芯片的等位判别都建立在这一热力学差异上；其代价是区分窗口窄，对 GC 含量与反应条件敏感。
- 引物延伸：利用 DNA 聚合酶对底物的双重选择——引物 3′ 末端错配则不延伸（等位基因特异 PCR(ARMS) 的原理），延伸时掺入的碱基又忠实拷贝模板（单碱基延伸(single-base extension)：引物紧邻 SNP 上游，只加一个标记的终止碱基，掺入哪种染料即为何种等位，SNaPshot 为代表）。聚合酶的忠实性把杂交的热力学区分转换为酶学的特异性区分，稳健性更高。
- 连接特异性：DNA 连接酶只有在两段寡核苷酸接头处的碱基完全配对时才催化磷酸二酯键的形成，SNP 恰置于接头处即可区分等位，代表为连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)（Landegren et al., 1988）。
- 侵袭切割：当检测探针与上游寡核苷酸在靶位点上重叠形成侵入结构时，瓣状内切酶(flap endonuclease, FEN)以结构特异性方式切下探针的 5′ 瓣片，切割产物再引发下一轮反应，实现等温、无需热循环的信号级联放大，即侵袭检测(INVADER assay)（Lyamichev et al., 1993）。
此外还有两类独立于上述分子识别的物理原理：其一是酶切——若 SNP 恰好破坏或创造限制酶识别位点，限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)以片段长度改变报讯，无需等位特异性试剂，但要求变异恰好落在酶切位点，通量极低；其二是质量——以 MALDI-TOF 质谱直接"称量"延伸产物的分子质量差（见 3.2.3 小节）。表 3.2-1 按原理、通量、多重化能力、成本结构与主要误差来源对代表性技术作系统比较。
| 技术 | 区分原理 | 典型通量 | 多重化能力 | 成本结构 | 主要误差来源 |
|---|---|---|---|---|---|
| PCR-RFLP | SNP 改变限制酶识别位点，片段长度改变 | 极低 | 无 | 低；无需专用设备 | 酶切不完全、凝胶分辨率不足 |
| ASO 杂交 / 杂交芯片 | 配对与单碱基错配的 Tm 差异 | 低（膜条）至高（芯片） | 高（阵列化） | 中；随位点数线性增长 | 交叉杂交、GC 依赖、严谨条件漂移 |
| ARMS（等位特异 PCR） | 引物 3′ 末端错配不能延伸 | 低至中 | 低（分管或双管） | 低；引物合成便宜 | 引物竞争、非特异扩增、假阴性 |
| 单碱基延伸（SNaPshot 等） | 聚合酶忠实拷贝模板的一个碱基 | 中 | 中至高（多重引物同管） | 中 | 延伸不平衡、相邻位点干扰 |
| 连接酶检测（LDR） | 连接酶要求接头处完全配对 | 中 | 中 | 中 | 连接温度敏感、探针设计约束 |
| INVADER 侵袭检测 | 侵入结构 + FEN 切割，等温级联放大 | 中（每反应单位点） | 中 | 中 | 荧光背景、结构非特异切割 |
| TaqMan 水解探针 | 探针中央错配降低水解效率（FRET 读出） | 中至高（384 孔板） | 低（一管单位点） | 位点固定成本高，样本边际成本低 | 探针非特异切割、杂合信号失衡 |
| MALDI-TOF 质谱 | 单碱基延伸产物的分子质量差 | 高（多重反应并行） | 高（同管数十位点） | 中；仪器投入高、试剂省 | 峰重叠、盐污染与结晶不良 |
| 高密度 SNP 芯片 | 阵列化杂交或单碱基延伸信号 | 极高（10⁵–10⁶ 位点/样本） | 极高 | 样本固定成本高，位点边际成本近零 | 交叉杂交、拷贝数状态干扰、批次效应 |
表中最右一列值得强调：不同原理的错误方向不同。杂交类技术的错误多为双向的信号混淆；ARMS 与等位特异延伸的典型错误是单向的等位丢失（allele drop-out）——一个等位的扩增或延伸效率显著偏低，杂合子被误判为纯合子。这类系统性的单向错误对下游统计的危害远大于随机噪声，是 3.2.5 小节质量控制的重点对象。
3.2.3 三个代表技术的机理细节
TaqMan 5′-核酸酶探针：双色探针与水解发光
水解探针(hydrolysis probe)分型的原型是 TaqMan 探针。针对每个位点合成两条仅 SNP 位点碱基不同、长度约 20–30 nt 的寡核苷酸探针，各自 5′ 端连接一枚报告荧光基团（分别用 FAM 与 VIC 两种染料标记两种等位）、3′ 端连接猝灭基团并阻断延伸。探针完整时，报告基团与猝灭基团相距仅数十个碱基的物理尺度之内，激发能量经荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)被猝灭基团吸收，几乎不发荧光。PCR 延伸阶段，Taq 聚合酶沿模板前进遇到与模板结合的探针时，其 5′→3′ 外切核酸酶活性把探针切成碎片——报告基团与猝灭基团分离，荧光恢复，且每条扩增产物分子对应一次切割，信号随循环指数累积（Holland et al., 1991）。等位区分的关键在于把 SNP 置于探针中央：与模板完全匹配的探针 Tm 较高，在退火与延伸温度下保持结合而被高效水解；中央错配的探针 Tm 下降、先行解离，被聚合酶置换而不被切割，通道几乎无信号（Livak et al., 1995）。
这一设计的工程优点是闭管均相：从扩增到信号读取在同一管内完成，不开盖、无产物污染风险，适合临床与大规模筛查。成本结构上，每个位点须定制一对探针，位点数是主要成本——因此 TaqMan 的经济区间是"少量位点 × 大量样本"，例如候选位点的独立验证与常规临床检测。
分子信标：茎环构象的双重严谨性
分子信标（molecular beacon）：一管一光的均相检测。分子信标是自身成茎环结构的荧光探针（Tyagi & Kramer, 1996）：中段为 15–30 nt 的环，与目标序列（SNP 置于中央）互补；两端为 5–6 nt 互相互补的臂。游离状态下臂自发配对形成发夹，使 5′ 端荧光基团与 3′ 端猝灭基团紧邻而被 FRET 猝灭；当环与完全互补的目标杂交时，茎被拉开、两端基团分离而发光。其特异性高于线性 ASO 探针：错配目标不仅要与环竞争，还须额外拆散茎的双螺旋——两道能垒叠加，使单碱基错配在较宽的温度范围内都能被区分。与 TaqMan 探针不同，分子信标可逆结合、不被水解，适用于等温检测与实时监测；配合不同颜色的荧光基团可在同一管内多重检测。它同样以"一管一光"的均相方式完成读出：杂交即发光、错配即沉默，无需分离洗脱步骤。
MALDI-TOF 质谱：以质量差判型
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF mass spectrometry)分型把读出环节交给物理量。分析物与基质共结晶，激光照射下基质吸收能量、使分析物解吸并电离；离子在电场中加速后飞过无场漂移管，到达检测器的飞行时间与质荷比的平方根成正比——质量越大的离子飞得越慢，据此可直接"称量"分子。分型流程为：PCR 扩增包含 SNP 的短片段；以碱性磷酸酶清除残余 dNTP；加入紧邻 SNP 上游的延伸引物与四种双脱氧核苷酸，进行单碱基延伸——引物只能加上一个终止碱基，其种类忠实拷贝模板。延伸产物之间的质量差即等位碱基之间的质量差：四种双脱氧核苷酸残基彼此相差约 9–40 Da（如 G 与 A 相差约 16 Da），完全在 MALDI-TOF 的分辨率之内；杂合子的两种延伸产物以两个独立的峰并存。该技术无需荧光标记，质量是分子的内禀属性、不随仪器条件漂移；通过给不同位点设计不同长度的延伸引物，使各产物落在互不重叠的质量窗口内，可在同一反应中并行数十个位点（图 3.2-2）。
3.2.4 高密度芯片平台与 DNA 池化
当位点数从几十个跃升到全基因组规模，通量的瓶颈转移到高密度 SNP 芯片(high-density SNP array)。两大平台代表了两种实现路径。Affymetrix 路线沿用第 2 章所述的原位合成(in situ synthesis)：以光刻掩模在硅片上逐碱基并行合成大量 25-mer 探针。对每个 SNP，芯片并非只用一条探针，而是布置一组等位特异性探针——分别终止于两种等位碱基、且错开 SNP 在探针中的位置，同时辅以故意中央错配的对照探针；比较两组探针的杂交强度模式判读基因型。早代的 Mapping 系列芯片（10K 至 500K）还用限制酶酶切加通用接头 PCR 做全基因组缩减代表性富集，把杂交目标控制在芯片容量之内。Illumina 路线则把位点特异性探针连在微珠上随机自组装成阵列（BeadArray），以全基因组扩增产物为底物：位点探针捕获靶片段后，在探针末端进行等位特异性单碱基延伸并掺入带标记的碱基，扫描微珠荧光即得基因型（Gunderson et al., 2005）。两条路线的共通量级是：一次实验、一份样本，读取 10⁵–10⁶ 个位点——每基因型的边际成本降到远低于一分钱的量级。芯片位点的遴选依赖单倍型结构与标签 SNP 的原理，这属于下一节（3.3 节）的主题；正是芯片的成本曲线使 3.5 节的全基因组关联研究在 2000 年代中期成为可能。
在芯片时代，DNA 池化(DNA pooling)是进一步压缩成本的策略：把 N 个个体的 DNA 等量混合成一池，对池而非个体做分型，测得的是池内等位基因频率而非逐个体基因型，反应数降为个体分型的 1/N。其省钱逻辑直接，误差代价同样明确：其一，等量混合在操作上不可能是精确的等摩尔混合，移液体积的微小偏差即引入频率噪声；其二，位点与等位特异性的扩增、杂交或延伸偏差会使某一等位的信号系统性偏高；其三，也是最根本的，池化不可逆地丢失了个体基因型信息，病例–对照比较只能退化为池间频率比较，无法在家系或需要基因型层面的模型中使用。
因此池化的合理位置是两阶段设计的初筛：第一阶段以病例池对对照池在全基因组范围内筛出频率差异最大的候选位点，第二阶段对候选位点逐一做个体分型验证。初筛可以便宜，验证必须准确。
3.2.5 分型质量控制
分型数据在进入任何统计检验之前必须通过质量控制。第一项指标是呼叫率(call rate)，即成功判读的基因型占应判读总数的比例，须在样本与位点两个层面分别考察：某样本全板呼叫率偏低，通常提示 DNA 降解、浓度不准或抑制物污染，应剔除或重抽提；某位点在多数样本中均无置信判读，则多为探针或引物设计失败，应弃用该位点。常用筛选线（如样本与位点呼叫率不低于 95%–98%）依研究规模与平台设定，此处为数量级示意。第二项是重复一致性：按盲法混入 5%–10% 的重复样本，同一 DNA 两次独立分型的一致率应显著高于 99%，否则整批数据的可信度存疑。
第三项检验利用群体遗传学的先验：哈代–温伯格平衡(Hardy–Weinberg equilibrium, HWE)。在随机婚配、无选择与无分层的理想条件下，对照样本中基因型频率应接近 p² : 2pq : q²（其原理将在 3.6 节展开）。某位点对照样本中杂合子显著少于预期（"杂合子缺失"）是分型错误的经典指纹——等位丢失使部分杂合子被误判为纯合子；但偏离同样可能来自真实的群体分层或选择压力，因此 HWE 检验是筛查手段而非判决，命中后须回到簇图逐点核查。第四项适用于家系样本：孟德尔错误(Mendelian error)，即子代基因型在给定亲代基因型下不可能出现的等位传递（如父母皆为 AA 而子代检出 A G）。三口之家中每一个此类不一致都直接指向该样本在该位点的错误，可精确地定位并剔除。
上述指标最终都要落到对原始信号的检视上。图 3.2-3 展示等位判别簇图的质控读法：每份样本按两个荧光通道的终点信号作点，三种基因型应聚成三簇；簇的位置漂移、分裂或大量中间点，就是错误正在发生的直接证据。
习题 3.2-2
图 3.2-3 中，若干样本点落在 A/A 纯合簇与期望杂合簇之间的漂移小簇处；实验室对其中两份样本重复分型，一次判为 A/A、一次判为 A/G。同一位点在全部对照样本中的杂合子比例亦显著低于哈代–温伯格预期。请判断这些样本最可能的真实基因型与最可能的技术成因，并给出处置建议。
参考解答最可能的真实基因型是 A/G 杂合子。成因：针对等位 G 的探针（或引物）与该位点周边序列存在额外错配、或扩增/延伸效率系统性偏低，导致 G 通道信号部分丢失（等位丢失），杂合子的信号点整体向 A/A 方向位移，重复实验中信号在判读阈值附近摆动，故两次判读不一致。这与对照样本杂合子缺失的 HWE 信号相互印证。处置：将漂移簇内的样本一律改判 no-call 并重测；若重测后漂移依旧、且该位点对照 HWE 偏离持续显著，则判定为位点设计缺陷，弃用该位点或重新设计探针——不可强行按原判读纳入统计。
分型错误在关联检验中的稀释效应。在病例与对照中错误率相同的非差异错分模型下，可以证明关联检验统计量按约 (1 − 2e)² 的因子衰减（e 为对称错分率）：错误率为 1% 时检验统计量约衰减 4%，功效相应下降，比值比估计向 1 回归——真信号被系统性稀释而非消失，因而更具迷惑性。危害在两种情形下急剧放大：其一，稀有等位基因的相对误差远大于常见等位（同样的绝对错误率作用于低频等位，等于巨大的相对偏差）；其二，若错误率在病例与对照之间不一致（差异错分，如两批样本在不同平台或不同日期分型），错误不仅稀释、还可以制造假阳性。在百万位点、严格多重检验校正的全基因组尺度上，即使只有千分之一位点的系统性错误，也可能留下数百个假信号。这就是质量控制必须先于统计分析的原因。
3.2.6 技术选型决策
把上述技术放回成本框架，选型问题可以归结为一个简单的结构：设样本数为 N、位点数为 L，总成本近似为"每样本固定成本 × N + 每位点固定成本 × L + 边际反应成本 × N × L"。TaqMan 与 ARMS 的每位点固定成本高（定制探针或引物对）、每样本边际成本低，经济区间是少量位点 × 大量样本——临床单位点检测、GWAS 命中位点的独立验证；高密度芯片相反，每样本固定成本高、位点边际成本近零，经济区间是大量位点 × 大量样本——全基因组关联扫描本身。当两个维度都小（如一个家系中的连锁分析），几乎任何技术都可行，酶切与常规电泳即可胜任；当两个维度都大且还需要发现新变异时，第三代选择登场：NGS 重测序把发现与分型合为一体——对目标区段或全基因组测序，比对后直接读出基因型，同时捕获 SNP、indel 与稀有变异，无需逐位点设计探针（多重目标区段捕获测序与简化代表性行测序是其低成本变体）。以重测序为基础的分型自 2010 年前后逐渐取得主导地位（原书出版于 2009 年，彼时这一转折刚刚开始，书中仍以芯片与单位点技术为主线）。
技术会更替，成本逻辑不变。从 RFLP 到 ASO、从 TaqMan 到芯片再到重测序，每一代技术都在"位点固定成本"与"样本边际成本"之间重新分配负担，也在改变错误的形态（杂交混淆、等位丢失、批次效应、比对歧义）。因此审读任何分型研究时，与其问"用的是哪种技术"，不如问三个问题：该技术在错误率与错误方向上如何表现；错误在病例与对照之间是否对称；以及质量控制指标（呼叫率、重复一致性、HWE、孟德尔错误）是否报告并达标。这三个答案决定数据可信度的边界，与技术名称无关。
最后应强调：选型是组合而非单选。典型的大规模关联研究采用两阶段流程——第一阶段以芯片或池化完成全基因组初筛，第二阶段以 TaqMan、质谱或靶向重测序在独立大样本中对命中位点逐一验证。初筛追求便宜与覆盖，验证追求准确与可信；把两类技术用在各自的经济区间，才是对"发现—分型"分工的完整回答。
习题 3.2-3
为以下三个研究场景各选一种最合适的分型技术，并从位点数、样本量、成本结构与误差特征四方面说明理由：(1) 某临床实验室每日约 300 份样本，检测一个药物代谢基因上的单个功能性位点；(2) 对 2000 名病例与 2000 名对照开展全基因组关联扫描的初筛阶段；(3) 对某模式生物的 20 个品系启动遗传研究，需要发现并读出其全基因组的新 SNP。
参考解答(1) TaqMan 或 ARMS 一类闭管单位点方法：位点仅一个，探针/引物的一次性设计成本可被大样本摊薄；闭管操作污染风险小、流程标准化，适合临床高通量日常；误差主要为偶发等位丢失，可通过重复与阳性对照监控。(2) 高密度 SNP 芯片（预算受限时可辅以病例池/对照池初筛）：数十万位点的规模下芯片的位点边际成本近零，且每样本固定成本可被两位数至六位数样本量摊薄；池化能把初筛成本再降一个量级，但引入频率估计噪声并丢失个体基因型，命中位点仍须个体分型验证。(3) NGS 重测序（可用简化代表性测序降低成本）：这是"发现 + 分型一体"的场景——品系少而需要的是新变异，芯片无现成位点可买，重测序一次同时给出新 SNP 的发现、频率估计与各品系基因型；比对歧义与测序错误是主要误差源，需按 3.2.1 的流水线控制。
关键术语
- 变异发现 (variant discovery)
- 在群体样本中寻找未知多态位点，强调灵敏度与假阳性控制，等位频率只需粗估。
- 基因分型 (genotyping)
- 对已知位点在大样本中逐一判读基因型（AA、Aa、aa），强调准确率、通量与单位点成本。
- 读段堆叠 (pileup)
- 将比对到同一基因组位置的读段碱基按列叠放的结果，SNP 发现即在其错配列中甄别。
- 等位基因特异性寡核苷酸 (allele-specific oligonucleotide, ASO)
- 仅中央碱基不同的一对探针，利用配对与单碱基错配的解链温度差区分等位基因。
- 单碱基延伸 (single-base extension)
- 引物紧邻 SNP 上游、只掺入一个标记终止碱基的酶学等位判别反应，为 SNaPshot 与质谱分型共用。
- 水解探针 (hydrolysis probe)
- 5′ 报告基团与 3′ 猝灭基团经 FRET 猝灭的探针，被 Taq 外切核酸酶水解后释放荧光（TaqMan）。
- 分子信标 (molecular beacon)
- 茎环构象荧光探针，目标互补时茎被拉开而发光，特异性高于线性探针。
- 侵袭检测 (INVADER assay)
- 以侵入结构与瓣状内切酶的结构特异性切割实现等温信号级联放大的分型方法。
- MALDI-TOF 质谱分型 (MALDI-TOF genotyping)
- 以飞行时间直接测量单碱基延伸产物的分子质量差判型，无需荧光标记、可多重化。
- 高密度 SNP 芯片 (high-density SNP array)
- 以阵列化杂交或单碱基延伸一次读取 10⁵–10⁶ 位点的固定探针分型平台。
- DNA 池化 (DNA pooling)
- 将多个个体 DNA 混合测池内等位频率以压缩成本，代价是引入技术方差并丢失个体基因型。
- 孟德尔错误 (Mendelian error)
- 家系中子代基因型与亲代不相容的传递，直接指示该样本该位点的分型错误。
参考文献与延伸阅读
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- Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′→3′ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88: 7276–7280.
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